Estudo isotópica da cinética de L-Arginina …

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Abstrato

Palavras-chave: Arginina, sepse, óxido nítrico, Estudo isotópica, Pseudomonas aeruginosa. óxido nítrico sintase, um Absorção fraccionai

Introdução

A sepse E UMA RESPOSTA inflamatoria sistêmica à Infecção, resultando em altas taxas de morbidade e Mortalidade [, 2 1]. Tem SIDO Bem estabelecido Que o óxido nítrico (NO) desempenha hum papel essencial na fisiopatologia da sepsia [3]. Em Estudos Anteriores, mostrou-se that como Espécies de Azoto reactivo (RNS), Que É Formado A Partir de NO e de superóxido, desempenham hum papel prejudicial na lesão pulmonar aguda (LPA), soluçar uma forma de peroxidação lipídica, Oxidação de Proteínas , a inactivação da enzima e, eventualmente, morte celular [4]. Além Disso, demonstrou Formação excessiva de NO desempenha hum Importante papel na patogénese de choque na sepsia e No ALI [5].

Como pelo substrato crítico da Síntese de NO, L-arginina, um aminoácido semi-essencial, TEM Recebido Crescente Atenção em referem-se a sepse Durante uma Década jornal Última [6].

Sob condições fisiológicas, a L-arginina ê envolvido em varias vias metabólicas, incluíndo a Síntese de Proteínas NÃO APENAS NO, mas also Como creatina, ureia, poliaminas, prolina, glutamato, etc e agmatina Na sepse, a cinética destas vias metabólicas ea metabólica destino de L-arginina PODE Ser significativamente Alterado Por causa da cha-NGES induzida POR Inflamação NAS Actividades enzimáticas correspondentes destas vias [12 -15]. Estudos TEM mostrado that MUITAS destas Mudanças São Específicos de Órgãos, devido Ao facto de that o metabolismo da L-arginina E Altamente compartimentado [16 -18]. Anteriormente, o metabolismo da L-arginina não Fígado, rim, intestino e TODO O Corpo [19 -21] Durante sepse were investigadas utilizando Técnicas de traçador isotópicos. This Técnica e Considerada o Método Mais Preciso parágrafo Estudar a cinética da via L-arginina e uma Produção de NO na Vivo [22]. No entanto, existem poucos Estudos isotópicos de metabolismos LOCAIS L-arginina Nos pulmões, especialmente soluço condições de Doença.

Para Além das alterações Cardiovasculares (Por Exemplo, estado hiperdinâmica) Que ocorrem Durante a sepsia, o nivel de plasma de L-arginina TEM SIDO demonstrado parágrafo Diminuir significativamente em sepsia [23, 24]. pedimos POR ISSO como seguintes Perguntas: 1) Qual E uma Entrega Total de L-Arginina PARA O PULMÃO Durante a septicemia? 2) Como E Que a Mudança da taxa metabólica L-Arginina Nos pulmões SÉPTICAS? E, 3) Qual É O diretor destino metabólico de L-Arginina? Para responder a essas Perguntas, foi Utilizado hum modelo de ovinos de pseudomonas sepse imitando a Circulação hiperdinâmica em patients Septicos e L- [15 N2 -guanidino, 5, 5, 2 H2 ] L-arginina Como hum traçador Para examinar a cinética de L-arginina não pulmão. Por ISSO foi CRIADO parágrafo Investigar quantitativamente o metabolismo Alterado pulmonar de L-Arginina, um TER Uma Fim de Melhor Compreensão dos Efeitos Sobre o metabolismo de sepse pulmonar arginina.

MATERIAIS E MÉTODOS

Tetra-rotulados L- [N 152 -guanidino, 5, 5- 2 H2 ] Arginina. HCl ([T4] Arg; 99% de Abundancia), were Adquiridos da MassTrace (Woburn, MA). N g de sal de etilo -Me-Thyl-L-arginina (M7033) foi adquirido A Partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

PREPARACAO Cirúrgica

Sete Ovelhas Fêmea (peso corporal = 32,4 2,0 ​​kg) were utilizados Neste Estudo. DEPOIS de hum jejum de 12 h, como Ovelhas were anestesiados com 1,5-2,5 vol% halotano em Oxigênio, ea anestesia foi mantida com halotano em Oxigênio (1,0-1,5 vol%). Artéria femoral Direita e cateteres venosos were colocados atraves de Uma incisão femoral e Avançar Para a aorta abdominal e veia cava inferior, respectively. Um cateter de diluição térmica de Swan-Ganz (modelo 93A-131-7F, American Edwards Laboratories, Irvine, CA) foi posicionado atraves da veia jugular Pará um pulmonar Artéria. DEPOIS de Uma toracotomia lateral, Esquerda não intercostal quinto Espaço, um silástico cateter (0062 em ID, em 0125 OD; .. Dow Corning, Midland, MI) inserido foi na aurícula Esquerda. Apos o fechamento da ferida, Os animais were retirados da Ventilação pulmonar e deixadas a Recuperar Durante Pelo Menos 5 dias. Durante este tempo, como Ovelhas were monitorados Três vezes por día Para uma aparencia, a adequação do Controle da dor, temperatura, ingestão oral, ea saida e urinaria fecais. Se a temperatura do Corpo excedeu 39.6exceeded 39.6C, o Tratamento antibiótico intravenosa foi iniciada e mantida Até Que a temperatura fazer era Corpo normal, Durante 24 h. De Todos os Antibióticos were parados no dia Antes da Experiência. Durante OS periodos de Recuperação e de Estudo, Os animais were mantidos em gaiolas metabólicas com Livre Acesso a comida e Água. O Dia Antes da Experiência, Os animais were anestesiados com cetamina, e hum cateter de Foley uretral retenção urinaria foi colocado. Disso DEPOIS, Todas como Ovelhas estavam Ligados a Lavagem continuamente transdutores de pressao (Baxter, Irvine, CA), that were Ligados a monitores hemodinâmicos (78304A modelo, Hewlett-Packard, Santa Clara, CA). Os animais receberam Uma infusão Contínua de Ringer com lactato (2 ml / kg / h), e uma urina foi recolhida Até Que a Experiência foi iniciada.

PREPARACAO bacteriana

Protocolo experimental

Carneiros recebeu Uma infusão constante de aprontado-L- [N 152 -guanidino, 5, 5, 2 H2 ] Doses Preparatória COM UMA L-arginina de 18 mol / kg e taxa de infusão de Alvo de 0,3 mol / kg / min Durante 28 horas. Apos 4 horas Iniciais (Controle de fase) do isótopo de infusão de L-Arginina, Uma infusão Contínua de vida Pseudomonas aeruginosa Bactérias uma dose Uma de 610 6 unidades formadoras de colónias (CFU) / kg / h Durante 24 horas (fase séptico). Nenhum diâmetro 20 horas, Uma infusão de 6,6 mg kg / hr L-NMA começou Durante 4 horas (fase de Bloqueio NOS). No Inicio de L-Arginina isótopo infusão (0 min, Uma Amostra UNICA) e 50 Minutos Antes do final de fase de Cada, Uma série de Amostras de sangue a Partir da arteria pulmonar (PA) ea aorta (A) were Tomadas parágrafo Determinação de fase Planalto Enriquecimento isotópico. O Intervalo de ritmo between each série de Amostras foi de 10 min (ver Figura 1).

Protocolo parágrafo experimental L- traçador isotópico [15 N2 -guanidino] arginina Estudos de infusão. Isotópica traçador arginina L- [N 152 -guanidino] foi infundido COM Preparatória de dose Uma de 18 mol / kg e Taxa de infusão de Alvo de 0,3 mol / kg / min de Durante 28 horas. .

Análise de Amostras

enriquecimentos OS isotópicas fazer traçador arginina Marcada sem sangue total de were medidos utilizando o Método descrito anteriormente [25, 26]. Resumidamente, como Amostras de Sangue Total de desproteinizados were COM 10% sulfossalicilico de ácido (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) e armazenado a -70 ° C num congelador, comeu Ser Utilizado Para a Análise. enriquecimentos de isótopos estáveis ​​de arginina were medidos em 500 ul de sobrenadante isento de proteína. Cada Amostra foi Passada atraves de Uma Coluna de permuta iónica, e em SEGUIDA, OS Derivados de éster metílico do trifluoroacetilo OS Aminoacidos were Preparados utilizando hum Procedimento comparável à de Nissim et ai. [27]. Como abundâncias isotópicas were determinados utilizando Injecção directa na Coluna, com hum cromatógrafo a gás (modelo 5980 série II, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA) acoplado a hum espectrómetro de massa (5988A modelo, Hewlett-Packard). Monitorização iónica selectiva de arginina foi Realizado não [M – 20] – Iao com utilização de ionização química negativo, com metano Como gás Reagente. Este Iao corresponde a Uma Perda de HF a Partir do Iao molecular. Monitorização iónica selectiva foi realizada uma Razão de massa-tocharge (m / z) 456 em / z 457 Pará e naturais [13] C-guanidinolarginine (M + 1) em / x 458 em / x 460 Pará [5, 5 2 H2 ] Arginina (M + 2) e [T4] Arg (M + 4). Uma Abordagem Múltipla de Regressão linear foi utilizada parágrafo Calcular a Abundancia isotópica dos amino Ácidos a Partir dos Dados de espectrometria de massa.

Cálculos

Detalhes dos Cálculos e medições quantitativas Pará na Vivo metabolismo de Aminoacidos Dentro de hum Orgão were mostrado na Nossa Publicação anterior [28]. Resumidamente, a Fracção fazer EMITIDO total de L-arginina Ser metabolizado Dentro dos pulmões, farg. E: farg = (PAarg EPA, arg – UMAarg EHum, arg ) / PAarg EPA, arg .

Onde [PAarg ] E [Aarg ] São, respectively, como concentrações de L-arginina na pulmonar Artéria (a pulmões entrada parágrafo OS) e aorta (SAÍDA dos pulmões, assumindo Que Não Há metabolismo da L-arginina não ventrículo Esquerdo); [EPA, arg ] E [EHum, arg ] São OS enriquecimentos de L- [N 152 -guanidino, 5, 5, 2 H2 ] L-arginina na arteria pulmonar (PA) e a aorta (A) no estado de Equilíbrio isotópico.

Fornecimento arterial pulmonar total de de L-arginina metabolizado Nos pulmões Marg.lung. E:

Um total Produção de NO A Partir de TP pulmõesNitr. E:

A taxa total de de Produção de nitrato de Entrega arterial pulmonar de L-arginina Nos pulmões (PUMA ) Fornecerá INFORMAÇÕES se uma alteração da Concentração de L-arginina sem sangue PA vai afetar a Produção de No nos pulmões.

estatisticas

A Análise estatística foi realizada Pela Análise de Variância (ANOVA) parágrafo Medidas repetidas parágrafo detectar Diferenças Dentro de hum grupo, e com ANOVA fatorial parágrafo Medidas repetidas parágrafo detectar Diferenças entre OS grupos, com post hoc Análise Feita com Fishers Procedimento Diferença Menos significativa. Bonferroni de Correção parágrafo comparações multiplas foi Utilizado when apropriado. A significância Estatística estabelecido foi em p 0,05. Os Dados São apresentados Como Médias SEM.

Resultados

A Distribuição totais de arginina parágrafo OS pulmões Durante Reduzido foi uma fase de séptico

O Fluxo de sangue e Entrega Total de arginina PARA O pulmão Durante a fase séptico. A: Fluxo total de de sangue Nos pulmões Durante a fase séptico. o Fluxo sanguíneo pulmonar foi significativamente Elevados (TBFbasal = TBF 4.95 0.56 vs.séptico = 6,51 0,31, P * .

Pseudomonas perfusão Melhorada metabolismo arginina Nos pulmões

A Produção de NO aumentou Nos pulmões SÉPTICAS

Saida de nitrato Nos pulmões. Apos 24 horas de infusão de pseudomonas, a taxa de Produção de nitrato foi Elevada (Pnitate-basal * = 10,3 3,2 mol / kg / min vs. Pnitate-séptico * = 43,6 5,7 mol / kg / min, P @ 0,05), e .

O metabolismo arginina Aumentada Nos pulmões SÉPTICAS E principalmente Utilizado Para a Produção de NO

Discussão

Vale ressaltar Que houve numerosos Estudos that relatam L-Arginina metabolismo e Síntese a nivel sistémico. No entanto, devido Ao Seu Elevado grau de Respostas Específicas de Tecidos parágrafo condições patológicas, Informação detalhada Sobre o metabolismo da L-arginina em níveis de Órgãos indivíduos E AINDA Muito Necessário, um Fim de Obter hum Melhor Entendimento Sobre o papel Deste aminoácido versátil. Anteriormente, utilizando a Técnica de traçador isotópico, Deutz et al [21, 37] avaliaram OS Efeitos de endotoxemia na Síntese de NO locais em Diferentes Órgãos, Como Fígado, rins, intestino e músculo em ratos e modelo suíno. Com a Técnica MESMA, o Presente Estudo forneceu a Primeira Informação quantitativa Sobre a forma metabolismo de local de L-arginina Nos pulmões E modulada em grande modelo animal.

AGRADECIMENTOS

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